Wiele zdaje się wskazywać na to, że początki obecności franciszkanów w Zamościu wiążą się z pobytem w Rzeczypospolitej o. Józefa Pisculli, pierwszego z głównych przełożonych Braci Mniejszych Konwentualnych, który odwiedził Prowincję Polską. Po przewrocie protestanckim Synowie Biedaczyny w Polsce należeli do najliczniejszych w całym Zakonie. Kiedy Jan Saryusz Zamoyski zdobywał wykształcenie za granicą, poznał członków zakonnej wspólnoty, którzy nauczali na Wszechnicy w Padwie, jak też prowadzili tam ośrodek szerzenia czci św. Antoniego.
Około 1580 r. Wielki Kanclerz sprowadził braci konwentualnych do Szczebrzeszyna, dając początek okresowi rozwoju klasztorów franciszkańskich na ziemiach wschodnich kraju. Prowincja zakonna była mu wdzięczna za fundację klasztoru szczebrzeskiego, któremu darował wieś Kisielów, czyli Hyrzę.
Jeśli chodzi o ślady obecności pierwszego zakonnika św. Franciszka w Grodzie Zamoyskiego, to znajdziemy je w katedrze. Otóż podczas 1599 r. przybył tutaj o. Dominik Konwaliusz rodem z Neapolu, by prowadzić wykłady z teologii na założonej kilka lat wcześniej Akademii. Pozostała po nim pamiątkowa płyta w kaplicy na lewo od wejścia. Kolejnych franciszkanów Hetman postanowił osadzić w swoim mieście, czym zajęła się najprawdopodobniej Kapituła Prowincjalna, rozpoczęta 21 sierpnia 1603 r. pod przewodem wspomnianego generała o. Pisculli. Bracia w szaro-popielatych strojach przybyli do Zamościa owego roku po otrzymaniu od Ordynata dawnego kościoła parafialnego pw. Świętego Krzyża na Przedmieściu Lwowskim, które stanowiło zaplecze przygotowawcze podczas wznoszenia miasta.
W niedługim czasie franciszkanie postawili dla siebie pomieszczenia z drewna obok darowanej świątyni. Kiedy komisarz generalny Zakonu o. Jan Donat Caputo odwiedził młody konwent zamojski w roku 1615, zaznaczył w sprawozdaniu, że mieszka tam 17 braci, którzy prowadzą życie z wielką pobożnością, utrzymują się z jałmużny, jak też doświadczają od ludu oznak przywiązania, tudzież miłości. Jan Saryusz myślał o przeniesieniu wspólnoty do wnętrza twierdzy. Sprawa stała się nagląca, kiedy o. prof. Dominik został napadnięty w drodze od kościoła Świętego Krzyża do Akademii. Dopiero w 1627 r. spełniły się pragnienia franciszkanów, kiedy otrzymali oni dużą działkę blisko Bramy Lwowskiej, by mogli tam postawić kościół i klasztor. Otrzymali też pieczęć z Chrystusem pokazującym bok św. Tomaszowi, jako znak szczególnej więzi z miastem. Rok później młody ordynat przekazał klasztorowi kawałek ziemi na przedmieściu pod cegielnię, gdzie rozpoczęto wypalanie cegły.
18 lutego 1636 r. fundator podpisał nadanie określające po raz pierwszy granice projektu kościelno-klasztornego. Podarowana działka ciągnęła się wewnątrz grodu wzdłuż wschodniej ściany od Bramy Lwowskiej ku cerkwi ruskiej, zaś wszerz od umocnień obronnych do obecnej ul. Żeromskiego. Mur przy Bramie został oddany "dla użytku braci i godziwej dla nich rekreacji". Nie mogli oni zakładać tam swoich piwnic lub stawiać trwałych pomieszczeń, gdyż należało zapewnić swobodny dostęp obrońcom i działom.
W uroczystość św. Antoniego 13 czerwca 1637 r. położono kamień węgielny pod świątynię franciszkańską. Tomasz Zamoyski razem z małżonką Katarzyną z Ostrogskich postanowili przeznaczać rocznie 1600 florenów na potrzeby budowlane aż do ukończenia dzieła. Wkrótce sprawą zajął się jeszcze gorliwiej następca Tomasza - Jan zwany Sobiepanem. W roku 1643, kiedy kościół był już "nowozaczęty", 16-letni ordynat na prośbę gwardiana o. Ambrożego Wierusza wyznaczył miejsce pod przyszły klasztor. Sobiepan wezwał też właścicieli sąsiednich działek, by przekazali je zakonnikom, którzy mieli ze swej strony zapłacić im "godziwą cenę". Wspólnota zamojska przystąpiła więc do wykupu. Po spaleniu starego konwentu przez wojska kozackie w 1648 r. konieczne było przyspieszenie prac. Franciszkanie otrzymali prawo do korzystania z lasów ordynackich. W marcu 1655 r. biskup chełmski Stanisław z Buzynina Pstrokoński dał zgodę na przeniesienie zakonników do twierdzy.
Drewniany budynek klasztorny, który został wzniesiony na obecnym placu Wolności, nie wyróżniał się zapewne niczym szczególnym od innych domów Braci Mniejszych. Pozostawał on w cieniu kościoła, którego budowa pochłaniała wszelkie środki. Na początku 1657 r. wyższy przełożony Prowincji Litewsko-Ruskiej o. Franciszek Łaźniowski przeprowadził wizytację wspólnoty. Stwierdził, że brakowało pieniędzy na opłacenie rzemieślników i robotników. Powodem takiego stanu rzeczy było oblężenie szwedzkie z roku 1656 i zaraza, która przyszła rok później. 18 kwietnia 1658 r. wielki pożar wyrządził znaczne szkody zespołowi klasztornemu. W końcu, dzięki zabiegom gwardiana o. Wincentego Morza świątynia została otwarta w 1662 r.
Ojcowie Franciszkanie rozwijali pracę duszpastersko-kaznodziejską w całej okolicy. Prócz tego zajmowali katedrę teologii w Akademii Zamojskiej, zajmując się również przez pewien czas działalnością wydawniczą. Kiedy po pierwszym rozbiorze Polski miasto znalazło się pod władzą Austrii, cesarz Franciszek Józef wydał w roku 1784 rozporządzenie o zniesieniu klasztorów. Zakonnicy przenieśli się na jakiś czas do opuszczonej siedziby klarysek, potem jednak wrócili na własne miejsce, gdzie pozostali do roku 1809. Po upadku Księstwa Warszawskiego twierdza została zajęta przez wojska carskie. W roku 1820 rozebrano zniszczony klasztor, natomiast kościół po przerobieniu wnętrza na dwa poziomy został wykorzystany jako magazyn. Pod koniec XIX w. dokonano dalszych przekształceń, burząc wysokie szczyty świątyni oraz wygospodarowując trzy poziomy na koszary dla Kozaków.
Kiedy Polska odzyskała niepodległość w 1918 r., prowincjał franciszkański o. Alojzy Karwacki starał się odzyskać kościół zakonny. Podjęte w tym celu kroki zakończyły się niepowodzeniem. Pomieszczenia nadal służyły potrzebom świeckim jako siedziba Sejmiku Powiatowego oraz Domu Ludowego Polskiej Macierzy Szkolnej. Od 1926 r. w dawnej świątyni mieściło się kino miejskie o nazwie "Stylowy", później zaś dołączył teatr oraz Powiatowa Kasa Komunalna i Muzeum Regionalne. Po II wojnie światowej kino pozostało na dole, podczas gdy w górnej części znalazło się Państwowe Liceum Sztuk Plastycznych. Lata 70. przyniosły znaczne pogorszenie się stanu budynku.
Gdy generał Zakonu Redemptorystów z Rzymu o. Józef Pfhap odwiedzał miejscowych współbraci w roku 1981, zgłosił gotowość przejęcia kościoła pofranciszkańskiego. Ówczesne władze państwowe odrzuciły jednak taką propozycję. Dzięki rozgłosowi wokół tej sprawy podjęto wszakże podstawowe badania, wymieniono dach oraz tynki, jak również uratowano XVII-wieczny portal zachodni, zagrożony całkowitym zniszczeniem.
Kiedy Ojciec Święty Jan Paweł II wyznaczył Zamość na stolicę powstającej diecezji, przyczynił się jednocześnie do odzyskania kościoła dla franciszkanów. W dziele przywrócenia franciszkańskiemu kościołowi pierwotnego charakteru miał swój udział biskup diecezji zamojsko-lubaczowskiej Jan Śrutwa. Starania bp. Jana przyniosły upragniony owoc dzięki wsparciu "Solidarności". 23 maja 1993 r. Komisja Majątkowa Rządu RP zwróciła świątynię władzom kościelnym w obecności Księdza Prymasa Józefa Glempa. 28 lutego 1994 r. w Zamojskiej Kurii Biskupiej miało miejsce urzędowe przekazanie budynku ojcom franciszkanom, którzy powrócili do Zamościa po 185 latach nieobecności. Jako pierwsi przybyli o. Janusz Głazowski i o. Eugeniusz Wiraszko. Pierwsza Msza św. w odzyskanym kościele Zwiastowania Najświętszej Maryi Panny sprawowana była 25 marca 1994 r.
Obecnie, chociaż nie cały budynek został przejęty przez Braci Mniejszych Konwentualnych, ponieważ na piętrze znajduje się nadal Liceum Plastyczne, to jednak świątynia służy wiernym. Jest przez nich chętnie odwiedzana. 3 lipca 1994 r. powstała parafia franciszkańska. Od 1996 r., oprócz pracy parafialnej i katechetycznej, ojcowie służą posługą sakramentalną i duchową w klasztorze Sióstr Klarysek w Sitańcu.